肾实质性高血压INSR基因第8外显子多态性分析

最佳答案 - 由提问者2006-05-27 22:17:42选出

关键词：高血压

［摘要］ 目的 探讨肾实质性高血压胰岛素受体（INSR）基因第8外显子多态性，试图从遗传角度寻求病因。方法 采用多聚酶链反应（PCR）和限制性内切酶片段长度多态性分析（RFLP）的方法对38例肾实质性高血压肾功能正常者(RHNRF)、45例肾实质性高血压肾衰竭者(RHCRF)及38例正常血压者(NC)全血INSR基因第8外显子NsiⅠ多态性进行分析检测。结果 未发现中国人肾实质性高血压INSR基因第8外显子NsiⅠ多态性改变，两病人组N2等位基因频率与正常对照组比较无显著性差异（χ2=0.06、0.08，P>0.05）。结论 INSR基因第8外显子NsiⅠ多态性与中国人肾实质性高血压无关，N2等位基因并非其易感基因。


［关键词］ 高血压，肾性；肾衰竭，慢性；受体，胰岛素；聚合酶链反应；限制性片段长度多态性


INSULIN RECEPTOR GENE POLYMORPHISM ANALYSIS IN RENAL HYPERTENSIVE PATIENTSXU YAN, ZHOU HAIYAN, MA RUIXIA(Department of Nephrology,The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China)


［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the relationship between polymorphism of insulin receptor (INSR) gene Exon 8 and the etiology of renal hypertension. MethodsPolymerase chain reaction (PCR) combined with restriction fragment length polymorphism (RFLP) was used to detect and analyze the polymorphism of INSR gene Exon 8 in 38 renal hypertensive patients with normal renal function (RHNRF), 45 patients complicated by chronic renal failure (RHCRF) and 38 normal controls (NC). ResultsNo polymorphism of NsiⅠ in INSR gene Exon 8 was found to be correlated with renal hypertension in Chinese. N2 allele frequency of INSR gene had no difference between renal hypertension with or without chronic renal failure （χ2=0.06, 0.08;P>0.05）. ConclusionNsiⅠ polymorphism of INSR gene Exon 8 has no relation with renal hypertension in Chinese. N2 allele of INSR gene is not the correlated gene of renal hypertension.


［KEY WORDS］hypertension, renal; kidney failure, chronic; receptors, insulin; polymerase chain reaction; restriction fragment length polymorphism


高血压病人中由肾脏病引起者约占10%，继发性高血压病人中肾脏病引起者占第一位，原发性高血压（EH）中约20%最终发展至终末期肾病［1］。虽然关于高血压肾损害及肾脏疾病引起高血压的研究甚多，但对其确切的发生机制，至今未能完全阐明。本研究拟通过限制性内切酶片段长度多态性分析的方法，对肾实质性高血压病人的全血胰岛素受体(INSR)基因第8外显子多态性进行分析，从分子水平探讨肾实质性高血压的病因。


1 资料与方法


1.1 对象与分组


1.1.1 肾实质性高血压肾功能正常（RHNRF）组 38例，男18例，女20例，年龄25~68岁，平均（45.9±11.3）岁。①收缩压＞18.67 kPa，舒张压＞12.00 kPa；②肾活检诊断为各种肾实质性疾病引起的高血压，除外肾血管性高血压；③尿常规异常，血尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）尚在正常范围。


1.1.2 肾实质性高血压肾衰竭（RHCRF）组 45例，男23例，女22例，年龄23~69岁，平均年龄（46.3±12.7）岁。①、②同RHNRF组，③血BUN＞20 mmol/L，Cr＞445 μmol/L。


1.1.3 正常对照（NC）组 38例，男20例，女18例，年龄27~60岁，平均（42.9±8.7）岁。收缩压＜18.67 kPa，舒张压＜12.00 kPa，排除肾脏疾病及糖尿病，亦无高血压、肥胖及糖尿病家族史。


1.2 方法


1.2.1 临床及生化检查 病人均询问病史，测量血压、身高及体质量，计算体质量指数（BMI）；取空腹静脉血，用自动生化仪测定肾功能及血脂情况。


1.2.2 INSR基因第8外显子多态性测定 ①DNA提取：取静脉全血5 mL，用100 g/L EDTA抗凝， 采用美国Promega公司提供的DNA 提取试剂 期徐岩，周海燕，马瑞霞肾实质性高血压INSR基因第8外显子多态性分析59盒提取DNA。②PCR反应：引物设计参照文献［2］方法，由上海生物工程研究所合成。上游引物序列：5′CGGTCTTGTAAGGGTAACTG3′，下游引物序列：5′GAATTCACATTCCCAAGACA3′。PCR反应体系25 μL（DNA模板150 ng、dNTP 200 mol/L、上下游引物分别为20 pmol、10×Buffer 2.5 μL、MgCl2 2.5 μL、TaqDNA聚合酶1 U），PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min。③酶切：取PCR产物20 μL用限制性内切酶Nsi Ⅰ进行酶切，酶切产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外线显影、摄片。


1.2.3 统计学处理 采用SPSS 10.0 for Windows统计软件对资料进行统计分析。计数资料及组间频数的比较采用χ2检验；计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析。


2 结 果


2.1 一般临床资料比较


病人组除收缩压（SBP）、舒张压（DBP）显著高于对照组外，胆固醇（TC）、三酰甘油(TG)水平与正常组相比，均无统计学差异，具有可比性。见表1。


2.2 INSR基因表达情况标本经引物P1、P2行PCR扩增，扩增片段长度为322 bp（见图1）。


2.3 纯化后PCR产物的酶切鉴定


PCR产物经NsiⅠ内切酶消化后，紫外线灯下观察出现不同的条带。N1N1基因型只有长322 bp一条带，N1N2基因型有长322、238、84 bp三条带，N2N2基因型有长238、84 bp两条带。见图2。


2.4 各组等位基因频率


见表2。由表2可知，两病人组N2等位基因频率与NC组比较，差异无显著意义（χ2=0.06、0.08，P>0.05）。


3 讨 论


EH病人中约50%存在糖耐量异常或并发非胰岛素依赖型糖尿病，有学者认为高血压为一代谢性疾病，胰岛素抵抗（IR）和继发性高胰岛素血症可能会导致血压升高，参与EH发生、发展［3］。胰岛素通过INSR起作用，INSR的结构和功能决定了细胞对胰岛素作用的反应，是IR的重要原因之一。INSR是由多亚基组成的跨膜糖蛋白，由两


表1 各组一般临床资料比较（略）


图1 PCR扩增片段电泳结果


图2 纯化后PCR产物经NsiⅠ酶切反应结果


表2 INSR基因型及等位基因频率比较（略）


已有研究证实，INSR基因第8外显子多态性与EH有关，1991年，HANIS等［4］发现人工合成的INSR基因第8外显子具有多态性；1996年澳大利亚SCHRALER等［5］研究显示，INSR基因第8外显子Nsi Ⅰ多态性与高加索人EH有关，EH组N1等位基因频率高于正常对照组。而我国林从容等［6］研究结果则显示，INSR基因NsiⅠ多态性与中国人EH有关，但与前者不同的是中国EH病人N2而非N1等位基因频率高于正常组。之后进一步的研究显示，N2等位基因可能是男性EH的易感基因［7］。PCR扩增产物为长322 bp片段，INSR基因第8外显子含有NsiⅠ酶的特异性酶切位点［3］。纯化后PCR产物经NsiⅠ内切酶消化后，产生3种基因型条带，若6 244位核苷酸存在G→A碱基替换，则产生NsiⅠ切点（ATGCA▲T），称为N2等位基因。经NsiⅠ内切酶消化后，产生长238 bp和84 bp两个片段。反之，若6 244位核苷酸无G→A碱基替换，则不产生NsiⅠ切点，称之为N1等位基因，经NsiⅠ内切酶消化后，只有长322 bp一个片段。本文作者曾研究显示，INSR基因第8外显子NsiⅠ多态性与中国人EH，特别是与EH肾损害肾衰竭显著相关，N2等位基因可能是中国人EH，特别是EH损害并发肾衰竭的一个重要易感基因［8］。高血压是慢性肾衰竭尿毒症期最常见的并发症，关于肾脏病引起高血压的研究甚多，但对其确切的发生机制，至今未能完全阐明。肾素活性增高在肾血管性高血压早期及部分肾实质性高血压发生中起着重要的作用。近年来对肾脏排钠功能障碍致钠、水潴留造成容量扩张引起高血压给予了更多的关注，但在各种不同的肾实质疾病，高血压的发生机制不完全相同。IR、高胰岛素血症、糖耐量异常可能是尿毒症高血压的重要发病机制。尿毒症IR的发生机制目前尚未阐明，有人认为与尿毒症毒素积聚和代谢性酸中毒有关。本实验结果显示，肾实质性高血压，无论其是否伴发尿毒症，均未发现有INSR基因NsiⅠ的多态性改变。因此，至少目前尚不能用INSR基因多态性来解释肾性高血压并发IR的发生机制。同时，也证实了高血压并发尿毒症与尿毒症并发高血压确实存在不同的遗传基础。